充值送平台

当前位置:充值送平台 / 新闻动态 / 所内动态 / 正文

所内动态

Nature Methods | 何万中执行室原创开发可克隆电镜标志技术实现细胞中的单分子定位

楬橥时间:2020/08/13

近50年来,细胞的电镜成像范围依赖基于传统的抗体免疫金标志技术识别细胞中的蛋白质分子。传统免疫金标志技术,受到抗体及抗原的稳定性和特异性、化学固定剂、细胞切片浸透性,胶体金颗粒大小等因素影响,通常标志效率很低(低于10%),甚至无法标志,于是,普及情况只可标志上细胞切片外表的极少限制抗原 。此外, 传统免疫标志需要标志每一个切片,对于细胞组织样品大标准的标志是十分费钱、费时、费力的工作,比如对神经组织样品的系列切片三维分子水平成像需要对数以千计以上切片进行免疫标志。尽管目前超分辨率荧光显微学成像技术曾经可以对细胞中的分子进行单分子水平的成像,但因无法对没有标志的普及分子甚至细胞器成像,通常需要借帮于非常复杂低效的光镜-电镜联系成像技术来弥补,而且当分子富集度很高时也无法辨别单个分子。


进入基因时代后,细胞生物学家迫切希望电镜范围也可以开发出雷同光学显微成像范围广泛运用的 GFP标志,通过遗传操作来直接实现细胞及生物组织的电镜超微构制样品上单个分子的精准识别与定位,于是,可将此类基于遗传编码的标志技术称为可克隆电镜标志技术(或泛泛称之为电镜的“GFP”标志技术)。

充值送平台 目前科学家们执行了两类基于遗传编码的可克隆电镜标志技术。


第一类是诈欺标志蛋白介导开释超氧离子纠合3,3’-diaminobenzenidine后与浸金属离子反应形成高电子密度沉淀物示踪,但由于超氧离子扩散速度极快无法实现单个分子定位,只悦目相对密合空间的高浓度标志分子进行展示,例如Alice Ting研究组开发的APEX标志。


充值送平台 第二类是浸金属离子直接与标志蛋白结合形成纳米金属颗粒示踪,例如富含半胱氨酸的金属结合蛋白(Metallothionein,简称MT;抗冻蛋白AFP等)以及铁蛋白众纠合体(ferritin),但铁蛋白众纠合体太大不悦目做单分子标志。


充值送平台 2006年David DeRosier研究组首次提出诈欺纯化的MT蛋白结合金离子可形成纳米金颗粒的特性可用来开发可克隆电镜标志。随后其他几个小组执行诈欺MT开发可克隆标志技术,然而受技术限制(如高配景噪声导致特异性差,金离子无法有效进入细胞,合成金颗粒效率低,金颗粒太小等),迄今没有开发出悦目细胞超微构制成像的可克隆电镜标志技术。


何万中研究组基于David DeRosier提出的MT标志意睹,陈设改制MT(MTn,MTα),并执行了其他富含半胱氨酸蛋白(如抗冻蛋白AFP),开展了可克隆电镜标志技术的研发。经过十年的长期寻找储存,何万中研究组霸占了基于富含半胱氨酸的金属结合蛋白的可克隆电镜标志技术的一系列技术寻衅,终于研发出悦目细胞中单分子识别与切实定位的可克隆电镜标志技术。


充值送平台 其关键技术突破扼要先容如下:


基于Brust-Schiffrin方法(BSM)合成硫醇(RSH)包被的纳米金颗粒途理(图1b),何万中研究组从研究硫醇阴离子(RS-)浓度与三价金离子(Au3+)的比率(RS-/Au3+)正正在BSM合成金颗粒的作用入手,发现:传统的BSM金颗粒合成都是基于RS-/Au3+<2:1前提下会形成不可溶的1:1“之”字型RSAu(I)纠合物,经过强还原剂(NaBH4)还原成Au(0)自成核格事务署合成纳米金颗粒;而当RS-/Au3+≥2:1 前提下则会形成可溶的2:1 RSAu(I)化合物彻底抑制自成核格事务署纳米金颗粒的合成,称为“自成核抑制机制(ANSM)”。当富含巯基的标志蛋白加入上述BSM反应姿态中,编制自身会形成不可溶的1:1“之”字型RSAu(I)纠合物,以及标志蛋白的巯基与金离子形成雷同1:1 RSAu(I)的纠合物,二者均可同时称为成核中心合成纳米金颗粒,因而会有相当限制是非标志的配景噪声(图1b(1))。但正正在自成核抑制机制ANSM前提下,编制自身形成的可溶的2:1 RSAu(I)化合物无法成核,只有标志蛋白的巯基与金离子形成雷同1:1 RSAu(I)的纠合物称为成核中心形成纳米金颗粒,从而绝对避免了非标志自成核金颗粒配景噪声(图1b(2))。


ANSM金颗粒合成化学途理的关键发现,为后续可克隆标志技术正正在细胞中的实现与优化奠定了稳定的理论基础。

图1.基于遗传编码的可克隆电镜标志技术的开发


a.可克隆电镜标志技术意睹图。b.Brust-Schiffrin方法(BSM)合成纳米金颗粒途理,及一价金离子与硫醇的两种结合格事务署(1:1和2:1模式)。c.经典的BSM合成前提下(1)富半胱氨酸标志蛋白和1:1一价金硫醇盐纠合物均可同时形成金颗粒,何万中研究组发现了一种自成核抑制机制(ANSM)可以正正在可溶的2:1一价金硫醇盐前提下(2)特异性地正正在标志蛋白上合成纳米金颗粒(绝对抑制非标志自成核金颗粒配景噪声)。d.稳定表达Ost4-GFP-MTn的HeLa细胞的荧光显微像。e.预期Ost4-GFP-MTn蛋白上成功合成纳米金颗粒后正正在内质网(ER)膜上的定位图。f. 用基于ANSM的可克隆电镜标志技术治理过的HeLa细胞(表达Ost4-GFP-MTn)切片的电镜照片,显现高密度的纳米金颗粒成功定位于朝向细胞质的ER膜上。


何万中研究组诈欺单独新发现的自成核抑制机制(ANSM),成功的开发了一系列针对纯化的标志蛋白特异性合成2-6纳米大小的金颗粒技术,并证明纳米金颗粒是正正在单个标志分子上形成的。接下来何万中研究组诈欺简单的原核细胞(大肠杆菌编制)寻找优化出细胞中的标志蛋白上特异性合成纳米金颗粒的执行方案,获得了前所未有超高标志效率(图2a)。

发现金离子无法大量进入细胞,何万中研究组起首诈欺液氮冻裂法优化合成前提,然后优化出低温甲醇固定通孔获得优化的超微构制及高效率的金颗粒合成方法,并进一步用化学固定与化学通孔方法进行了方法验证。然后,何万中研究组将细菌姿态寻找出来的金颗粒合成优化前提拓展至简单的真核细胞(裂殖酵母)(图2b,c),发现:真核细胞中需要将还原态的未折叠标志蛋白进行保护巯基免受醛类化学固定剂的破坏能力合成纳米金颗粒,寻找出氧化保护标志蛋白的巯基方案,而且正正在化学固定和高压冷冻固定两种方案上寻找优化出悦目酵母的金颗粒合成方案。
着末,何万中研究组经过不懈的寻找,将细菌和酵母中寻找出来的金颗粒合成技术添补至哺乳动物细胞,霸占了正正在保证细胞超微构制前提下怎样正正在标志蛋白上高效合成纳米金颗粒的贫窭。


哺乳动物细胞氧化情况下(如ER内腔和线粒体基质)的标志蛋白为折叠状态,酵母的执行方案根蒂适用。可是哺乳动物细胞中还原情况(如细胞质中)的标志蛋白为未折叠状态,该执行方案标志效率极低且浸复率低,经过不断寻找,何万中研究组终于研发出了普适性更高更强健的新方案:冷冻替代固定前提下只用鞣酸(tannic acid)与醋酸铀联合低温脱水固定,避免运用巯基氧化剂和醛固定剂,实现保证细胞超微构制下高效合成纳米金颗粒,且不再受标志蛋白折叠状态限制。正正在HeLa细胞中对ER内腔(图2d),线粒体基质(图2e)及ER膜(朝向细胞质还原情况,图1d-f)三种定位模式的测试,表明:该金颗粒合成方案曾经高度成熟有效,浸复率极高,可以广泛添补运用。

图2.可克隆电镜标志技术正正在三种模式细胞(细菌,酵母和哺乳动物细胞)中的运用


a.表达MBP-FliG-MTn的大肠杆菌中合成纳米金颗粒。b.表达Ost4-GFP-MTα的酵母细胞中纳米金颗粒特异性定位于内质网膜(ER)上。c.表达Ost4-GFP-MTn的酵母细胞中纳米金颗粒特异性定位于核膜和内质网膜(ER)上。d.稳定表达GFP-MT-KDEL的HeLa细胞中纳米金颗粒特异性定位于内质网(ER)内腔中。e.稳定表达Mito-acGFP-MTn的HeLa细胞中纳米金颗粒特异线粒体(M)基质中。


此外,何万中研究组创建的基于自成核抑制机制正正在富含半胱氨酸标志蛋白上合成纳米金颗粒技术,合成前提比拟温和,接 近生理前提,还可以用来正正在纯化的标志蛋白上合成纳米金颗粒,可用来开发一系列新型单分子探针,甚至正正在cryoEM/CryoET/FIB-SEM均有运用潜力。何万中研究组诈欺大肠杆菌表达纯化的GFP Nanobody (GBP) 与 MT 标志的交融蛋白 GBP-MT, 去免疫标志细胞中表达的GFP标志蛋白, 展示出该技术可以广泛用来标志目前已有GFP标志的种种细胞及动物组织。


比拟基于抗体的传统免疫电镜标志技术,何万中研究组创建的此项基于遗传编码的可克隆电镜标志技术是对细胞电镜成像范围单分子识别定位的一项浸要革新,应该具有广泛的运用前景。如需了解详细的研究实质,可以查阅https://www.nature.com/articles/s41592-020-0911-z.,或浏览正正在线PDF版本:https://rdcu.be/b6aXc。

从右至左:何万中,姜招弟,金秀梅,李玉华


我所何万中执行室PTN项目姜招弟博士生、金秀梅和李玉华为本文的配合第一作家,其他作家包括何万中执行室刘思彤、赵沛、蔡新斌、刘颖、汤娅琦、孙晓斌、柳燕、胡艳勇、李明博士,杜立林博士及其执行室的刘晓曼博士、王影影博士生,蛋白质中心陈涉博士及蔡改红,化学中心齐湘兵博士。我所何万中博士为本文通讯作家。该研究由科技部973(2011CB812502、2014CB849902)及北京市牵制部资帮,正正在北京生命科学研究所完成。


 充值送百分之五平台|彩票充值40送80彩金|注册充值100送28彩票 充值赠送彩票平台_充值一元送18娱乐金沙_充值50送50彩票平台注册 充值送百分之二平台|每次充值都送10%平台|充值10送100彩票游戏 充值送2%彩票平台|充值100送38彩金|每次充值都送18彩票平台 充值送百分之五平台_每次充值都送10%平台_充值送百分之5彩票平台 充值送优惠彩票网站_彩票充值40送80彩金_充值1元赠送彩金电子游艺